sgRNA构建建议教程

1， 引物设计，https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/；

2， 引物退火，引物稀释到20nM，正反向引物分别取10ul混合，取0.5-1L水加热到沸腾，混合后引物放入，自然冷却到室温（2-4小时）；

3， 酶切连接，取200ng质粒（不用太多，减少自连），取5ul退火的引物，T4连接酶和内切酶10×bufffer分别取0.5ul，ddH₂O补到10ul

4， PCR仪器设置程序（时间紧张可以减少循环数或者减少循环内时间）

5， 产物用于转化；

6， PCR检测，用sgRNA引物，配合载体上引物PCR检测；

7， 送测序

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